Isolasi Protein Tanaman

Isolasi Protein Prosedur Stacy dan Aalen, dan Presipitasi (Pengendapan) dengan TCA

1. Daun sebanyak 0,1 gram digerus dengan ditambahkan 500 µL ekstrak buffer dalam keadaan dingin.
2. Homogenate yang dihasilkan dipindahkan ke eppendorf yang telah diisi dengan 250 µL ekstrak buffer,
3. Homogenate ditambahkan dengan 26 µL PMSF 40 mM dan diinkubasi selama satu jam dalam refrigerator dengan dishaker sekali 15 menit,
4. Sentrifugasi pada 13.000 rpm selama lima menit dengan suhu 40C. Supernatan yang didapatkan dipindahkan ke tabung eppendorf baru dan disimpan dalam refrigerator.
5. Pellet disuspensikan dengan menambah 500µL ekstrak buffer dan 26µL PMSF 40 mM (6,97 mg PMSF dalam 1 ml dMSO)
6. Inkubasi pada suhu 40C selama satu jam dan digoyang sekali 15 menit.
7. Sentrifugasi pada 13.000 rpm selama lima menit dengan suhu 40C.
8. Supernatan yang didapatkan dicampur dengan supernatant pertama dan diendapkan dengan TCA 20% (1 ml volume supernatan berbanding dengan 200 µL TCA 20%
9. Inkubasi pada suhu -200C selama satu jam.
10. Campuran kemudian disentrifugasi pada 13.000 rpm dengan suhu 40C selama lima menit,
11. Supernatan yang didapatkan dibuang dan peletnya dicuci dengan menambahkan 1000 ml aceton absolute,
12. Sentrifugasi dengan 13.000 rpm 40C selama satu menit.
13. Pellet yang didapatkan dicuci kembali dengan menambahkan 1000 ml aceton absolute,
14. Sentrifugasi 13.000 rpm 40C satu menit.
15. Pellet yang didapatkan adalah protein, untuk menghilangkan aseton pellet dikering anginkan.
16. Protein yang didapatkan dilarutkan dengan 15 µL aquabides dan selanjutnya dielektroforesis.

Rizki, S.Si., M.P.
Biologi-UNP, Plant Biotechnology-Brawijaya University

Full artikel klik di sini >>

Elektroforesis (SDS-PAGE)

Langkah SDS-PAGE

1. Pembuatan gel pemisah (sepating gel)
2. Pembuatan gel pengumpul (stacking gel)
3. Pemanasan sampel
4. Dilarutkan. Runing pada plate 1 dengan arus 28A dengan tegangan 110V dan pada plate 2 dengan arus 30A dan teganagan 130 V.
5. Gel direndam dalam staining untuk proses pewarnaan selama 20 menit
6. Gel direndam dalam destaining untuk proses pencucian 20 menit

Pesiapan Gel

1. Separating gel 12,5% dibuat dengan cara :
a) Siapakan tabung polipropilen 50 ml
b) Masukan 3,125 ml stock akrilamid dalam tabung
c) Masukan 2,75 1M tris pH 8,8 tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan
d) Masukan aquabides 1,505 ml, tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan
e) Masuka 75 µl SDS 10%, tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan
f) Masukan 75 ml APS 10%, tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan
g) Masukan 6,25 µl TEMED, tabung ditutup lalu digoyang secara perlahan
h) Segera tuang larutan kedalam plate pembentuk gel menggunakan mikro pipet I ml (dijaga jangan sampai terbentuk gelembung udara) sampai batas yang terdapat pada plate.

i) Perlahan tambahkan aquades diatas larutan gel dalam plate agar permukaan gel tidak bergelombang.

2. Biarkan gel memadat selama kurang lebih 30 menit (ditandai dengan terbentuknya garis transparan diantara batas air dan gel yang terbentuk) setelah itu, air yang menutup separating gel dibuang.
3. Setelah separating gel memadat, stacking gel 3% disipakan dengan cara yang sama pada prosedur diatas dengan volume larutan:

Full artikel klik di sini >>

Isolasi, purifikasi dan dialisis enzim protease

Isolasi Enzim Protease dari Hati ayam

1. Hati ayam sebanyak 2 gram digunting kecil-kecil kemudian digerus dengan mortal dingin (pemecahan secara mekanik) sambil ditambahkan dengan PBST-PMSF 5x V (pemecahan secara kimiawi). 
2. Kemudian dimasukan kedalam pipa polipropilen, dan di vorteks selama 10 menit, lalu disonifikasi (dengan gel ultrasonik) selama 10 menit dan kemudian di sentrifugal pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit. 
3. Pisahkan antara supernatan dan pelatnya 
4. Ambil supernatannya kemudian ditambahkan dengan etanol absolut dingin dengan perbandingan 1:1 untuk pencucian, setelah itu di inkubasi dalam refrigerator selama 1 jam pada suhu 40C untuk pemisahan etanol dan proteinnya 
5. Sentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 10.000 rpm 
6. Ambil endapan dan keringkan hingga bau etanol hilang, dan ditambahkan buffer tris CL 20 mM untuk penyangga agar protein tetap pada kondisi tersebut. Maka akan didapatkan ekstrak enzim kasar

Full artikel klik di sini >>

Protein

Protein

Protein merupakan polimer biologis yang mengekspresikan fungsi dari suatu sel. Protein tersusun dari suatu monomer yang disebut dengan asam amino. Asam amino ini akan saling berikatan membentuk suatu rantai polipeptida, di mana rantai polipeptida ini nantinya akan menyusun protein sehingga protein terlihat seperti memiliki bentuk 3 dimensi. Protein untuk dapat beraktivitas secara maksimal memerlukan komponen ekstra yang disebut sebagai kofaktor. Protein yang tidak berikatan dengan kofaktor ini disebut sebagai apoprotein (Clark dan Russel, 2005).

Struktur molekul protein sangat beragam, tetapi pada dasarnya protein merupakan polimer dari 20 asam amino. Polimer asam amino disebut polipeptida. Suatu protein terdiri dari satu atau lebih polipeptida yang terlipat dan terbelit membentuk suatu kesesuaian yang spesifik dengan fungsinya. Bentuk tiga dimensi atau konformasi protein ditentukan oleh urutan asam amino pada suatu polipeptida penyusun protein tersebut (Campbell et all., 1999). Dari segi tingkatannya terdapat empat tingkat struktur protein yaitu: struktur primer yang menggambarkansekuen linier residu asam amino suatu protein, struktur sekunder terbentuk karena adanya ikan hidrogen, stuktur tersier mengambarkan rantai polipeptida yang telah mengalami folding sempurna dan kompak dan struktur kuartener yang memperlihatkan asosiasi dua atau lebih rantai polipeptida yang membentuk multisubunit. (Clark, 2005)

Protein memiliki peran vital bagi makhluk hidup. Protein membentuk struktur organisme, memainkan peranan utama dalam reaksi regulasi, sebagai carrier molekul tertentu, sebagai molekul pertahanan dan terlibat dalam reaksi signaling. Protein disintsis di ribosom dan DNA yang mengkode pembentukan protein. Banyak sinyal dari perkembangan organisme yang menentukan kode yang mana yang akan ditranskripsikan dan ditranslasi menjadi produk akhir protein (Brady, 2005).

Struktur Protein

Struktur protein dapat diketahui dengan kristalografi sinar-X atau pun spektroskopi NMR. Namun, kedua metode tersebut sangat memakan waktu dan relatif mahal. Sementara itu, metode sekuensing protein relatif lebih mudah mengungkapkan sekuens asam amino protein. Prediksi struktur protein berusaha meramalkan struktur tiga dimensi protein berdasarkan atas sekuens asam aminonya. Dengan perkataan lain, prediksi tersebut meramalkan struktur sekunder dan struktur tersier berdasarkan atas struktur primer protein.

Metode prediksi struktur protein yang ada saat ini dapat dikategorikan ke dalam dua kelompok, yaitu metode pemodelan protein komparatif dan metode pemodelan de novo. Pemodelan protein komparatif (comparative protein modelling) meramalkan struktur suatu protein berdasarkan atas struktur protein lain yang telah diketahui. Salah satu penerapan metode ini adalah homology modelling, yaitu prediksi struktur tersier protein berdasarkan atas kesamaan struktur primer protein. Pemodelan homologi didasarkan atas teori bahwa dua protein yang homolog memiliki struktur yang sangat mirip satu sama lain.

Pada metode ini, struktur suatu protein yang disebut dengan protein target, ditentukan berdasarkan atas struktur protein lain atau protein templet, yang telah diketahui dan memiliki kemiripan sekuens dengan protein target tersebut. Selain itu, penerapan lain pemodelan komparatif ialah protein threading yang didasarkan atas kemiripan struktur tanpa kemiripan sekuens primer. Latar belakang protein threading ialah bahwa struktur protein lebih dikonservasi daripada sekuens protein selama evolusi; daerah-daerah yang penting bagi fungsi protein dipertahankan strukturnya. Pada pendekatan ini, struktur yang paling kompatibel untuk suatu sekuens asam amino dipilih dari semua jenis struktur tiga dimensi protein yang ada. Metode-metode yang tergolong dalam protein threading berusaha menentukan tingkat kompatibilitas tersebut.

Struktur protein dapat ditentukan dari sekuens primernya tanpa membandingkan dengan struktur protein lain berdasarkan pendekatan de novo atau ab initio. Terdapat banyak kemungkinan dalam pendekatan ini, misalnya dengan menirukan proses pelipatan (folding) protein dari sekuens primernya menjadi struktur tersiernya (misalnya dengan simulasi dinamika molekular), atau dengan optimisasi global fungsi energi protein. Prosedur-prosedur ini cenderung membutuhkan proses komputasi yang intens sehingga saat ini hanya digunakan dalam menentukan struktur protein-protein kecil.

oleh: Rizki, S.Si

Full artikel klik di sini >>