1. Pembuatan gel pemisah (sepating gel)
2. Pembuatan gel pengumpul (stacking gel)
3. Pemanasan sampel
4. Dilarutkan. Runing pada plate 1 dengan arus 28A dengan tegangan 110V dan pada plate 2 dengan arus 30A dan teganagan 130 V.
5. Gel direndam dalam staining untuk proses pewarnaan selama 20 menit
6. Gel direndam dalam destaining untuk proses pencucian 20 menit
Pesiapan Gel
1. Separating gel 12,5% dibuat dengan cara :
a) Siapakan tabung polipropilen 50 ml
b) Masukan 3,125 ml stock akrilamid dalam tabung
c) Masukan 2,75 1M tris pH 8,8 tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan
d) Masukan aquabides 1,505 ml, tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan
e) Masuka 75 µl SDS 10%, tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan
f) Masukan 75 ml APS 10%, tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan
g) Masukan 6,25 µl TEMED, tabung ditutup lalu digoyang secara perlahan
h) Segera tuang larutan kedalam plate pembentuk gel menggunakan mikro pipet I ml (dijaga jangan sampai terbentuk gelembung udara) sampai batas yang terdapat pada plate.
i) Perlahan tambahkan aquades diatas larutan gel dalam plate agar permukaan gel tidak bergelombang.
2. Biarkan gel memadat selama kurang lebih 30 menit (ditandai dengan terbentuknya garis transparan diantara batas air dan gel yang terbentuk) setelah itu, air yang menutup separating gel dibuang.3. Setelah separating gel memadat, stacking gel 3% disipakan dengan cara yang sama pada prosedur diatas dengan volume larutan:
a) 30% acrylamide-bis 0,45 ml
b) 1M tris pH 6,8 0,38ml
c) Aquabidest 2,11 ml
d) 10% SDS 30 µl
e) TEMED 5 µl
f) 10% APS 30 µl
4. Kemudian tuang staking gel
5. Pasang sisir tempat penyuntikan sampel, kemudian biarkan beberapa lama hingga gel memadat
6. Lepas sisir
7. Gel dalam plate dipasang pada alat elektroporesis ‘set mini protein gel’
8. Tuang running buffer
Injeksi Sampel dan Runing
1. Enzim murni dipipet sebanyak 15 µl kemudian dimasukan kedalam eppendorf
2. Tambahkan dengan 15µl RSB dan panaskan pada suhu 1000C selama 2 menit
3. Dinginkan pada suhu kamar.
4. Suntikan sampel sebanyak 10-20 µl kedalam sumur secara hati-hati dengan menggunakan Hamilton syringe.
5. Syringe dibilas dengan air atau runing buffer sebelum dipakai untuk memasukan sampel yang berbeda pada sumur gel
berikutnya.
6. Untuk memulai running, hubungkan perangkat elektroporesis dengan power supply dengan arus pada plate I 28 mA
tegangan 110 V dan Plate 2 30 mA dengan arus 130V
Pewarnaan Gel
1. Untuk tahap ini diperlukan larutan staining untuk mewarnai protein pada gel dan larutan destaining untuk
pencucian atau menghilangkan warna pada gel dan memperjelas band protein yang terbentuk.
a) Untuk membuat larutan staining 1 liter diperlukan
i. Coomassie Blue R-250 1,0 g
ii. Methanol 450 ml
iii. Aqudes 450 ml
iv. Asam asetat glasia 100 ml
b) Untuk membuat larutan destaining 1 liter diperlukan
i. Methanol 100 ml
ii. Asam asetat glasial 100 ml
iii. Aquades 800 ml
2. Gel direndam didalam 20 ml larutan staining solution sambil digoyang selama 20 menit, kemudian larutan
staining dituang kembali kewadahnya.
3. Kemudian dicuci dalam 150 ml asam asetat
4. Gel direndam dalam larutan destaining sambil digoyang selama 20 menit
5. Cuci dengan asam asetat sampai bening
Oleh: Rizki, S.Si.
Biologi-UNP, Plant Biotechnology-Brawijaya University
