Isolasi Protein Tanaman

Isolasi Protein Prosedur Stacy dan Aalen, dan Presipitasi (Pengendapan) dengan TCA

1. Daun sebanyak 0,1 gram digerus dengan ditambahkan 500 µL ekstrak buffer dalam keadaan dingin.
2. Homogenate yang dihasilkan dipindahkan ke eppendorf yang telah diisi dengan 250 µL ekstrak buffer,
3. Homogenate ditambahkan dengan 26 µL PMSF 40 mM dan diinkubasi selama satu jam dalam refrigerator dengan dishaker sekali 15 menit,
4. Sentrifugasi pada 13.000 rpm selama lima menit dengan suhu 40C. Supernatan yang didapatkan dipindahkan ke tabung eppendorf baru dan disimpan dalam refrigerator.
5. Pellet disuspensikan dengan menambah 500µL ekstrak buffer dan 26µL PMSF 40 mM (6,97 mg PMSF dalam 1 ml dMSO)
6. Inkubasi pada suhu 40C selama satu jam dan digoyang sekali 15 menit.
7. Sentrifugasi pada 13.000 rpm selama lima menit dengan suhu 40C.
8. Supernatan yang didapatkan dicampur dengan supernatant pertama dan diendapkan dengan TCA 20% (1 ml volume supernatan berbanding dengan 200 µL TCA 20%
9. Inkubasi pada suhu -200C selama satu jam.
10. Campuran kemudian disentrifugasi pada 13.000 rpm dengan suhu 40C selama lima menit,
11. Supernatan yang didapatkan dibuang dan peletnya dicuci dengan menambahkan 1000 ml aceton absolute,
12. Sentrifugasi dengan 13.000 rpm 40C selama satu menit.
13. Pellet yang didapatkan dicuci kembali dengan menambahkan 1000 ml aceton absolute,
14. Sentrifugasi 13.000 rpm 40C satu menit.
15. Pellet yang didapatkan adalah protein, untuk menghilangkan aseton pellet dikering anginkan.
16. Protein yang didapatkan dilarutkan dengan 15 µL aquabides dan selanjutnya dielektroforesis.

Rizki, S.Si., M.P.
Biologi-UNP, Plant Biotechnology-Brawijaya University

Full artikel klik di sini >>

Elektroforesis (SDS-PAGE)

Langkah SDS-PAGE

1. Pembuatan gel pemisah (sepating gel)
2. Pembuatan gel pengumpul (stacking gel)
3. Pemanasan sampel
4. Dilarutkan. Runing pada plate 1 dengan arus 28A dengan tegangan 110V dan pada plate 2 dengan arus 30A dan teganagan 130 V.
5. Gel direndam dalam staining untuk proses pewarnaan selama 20 menit
6. Gel direndam dalam destaining untuk proses pencucian 20 menit

Pesiapan Gel

1. Separating gel 12,5% dibuat dengan cara :
a) Siapakan tabung polipropilen 50 ml
b) Masukan 3,125 ml stock akrilamid dalam tabung
c) Masukan 2,75 1M tris pH 8,8 tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan
d) Masukan aquabides 1,505 ml, tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan
e) Masuka 75 µl SDS 10%, tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan
f) Masukan 75 ml APS 10%, tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan
g) Masukan 6,25 µl TEMED, tabung ditutup lalu digoyang secara perlahan
h) Segera tuang larutan kedalam plate pembentuk gel menggunakan mikro pipet I ml (dijaga jangan sampai terbentuk gelembung udara) sampai batas yang terdapat pada plate.

i) Perlahan tambahkan aquades diatas larutan gel dalam plate agar permukaan gel tidak bergelombang.

2. Biarkan gel memadat selama kurang lebih 30 menit (ditandai dengan terbentuknya garis transparan diantara batas air dan gel yang terbentuk) setelah itu, air yang menutup separating gel dibuang.
3. Setelah separating gel memadat, stacking gel 3% disipakan dengan cara yang sama pada prosedur diatas dengan volume larutan:

Full artikel klik di sini >>

Isolasi, purifikasi dan dialisis enzim protease

Isolasi Enzim Protease dari Hati ayam

1. Hati ayam sebanyak 2 gram digunting kecil-kecil kemudian digerus dengan mortal dingin (pemecahan secara mekanik) sambil ditambahkan dengan PBST-PMSF 5x V (pemecahan secara kimiawi). 
2. Kemudian dimasukan kedalam pipa polipropilen, dan di vorteks selama 10 menit, lalu disonifikasi (dengan gel ultrasonik) selama 10 menit dan kemudian di sentrifugal pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit. 
3. Pisahkan antara supernatan dan pelatnya 
4. Ambil supernatannya kemudian ditambahkan dengan etanol absolut dingin dengan perbandingan 1:1 untuk pencucian, setelah itu di inkubasi dalam refrigerator selama 1 jam pada suhu 40C untuk pemisahan etanol dan proteinnya 
5. Sentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 10.000 rpm 
6. Ambil endapan dan keringkan hingga bau etanol hilang, dan ditambahkan buffer tris CL 20 mM untuk penyangga agar protein tetap pada kondisi tersebut. Maka akan didapatkan ekstrak enzim kasar

Full artikel klik di sini >>