Kamis, 28 Januari 2010

Isolasi, purifikasi dan dialisis enzim protease




Isolasi Enzim Protease dari Hati ayam
  1. Hati ayam sebanyak 2 gram digunting kecil-kecil kemudian digerus dengan mortal dingin (pemecahan secara mekanik) sambil ditambahkan dengan PBST-PMSF 5x V (pemecahan secara kimiawi). 
  2. Kemudian dimasukan kedalam pipa polipropilen, dan di vorteks selama 10 menit, lalu disonifikasi (dengan gel ultrasonik) selama 10 menit dan kemudian di sentrifugal pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit. 
  3. Pisahkan antara supernatan dan pelatnya 
  4. Ambil supernatannya kemudian ditambahkan dengan etanol absolut dingin dengan perbandingan 1:1 untuk pencucian, setelah itu di inkubasi dalam refrigerator selama 1 jam pada suhu 40C untuk pemisahan etanol dan proteinnya 
  5. Sentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 10.000 rpm 
  6. Ambil endapan dan keringkan hingga bau etanol hilang, dan ditambahkan buffer tris CL 20 mM untuk penyangga agar protein tetap pada kondisi tersebut. Maka akan didapatkan ekstrak enzim kasar


Purifikasi enzim protease bertingkat

A. Pengendapan dengan amonium sulfat 0-20%
a. 10 ml ekstrak enzim kasar dimasukan kedalam beaker glass dengan penambahan 1,14 gr amonium sulfat secara perlahan dan kemudia distirer.
b. Kemudian didiamkan selama 30 menit pada suhu 40C
c. Setelah itu sentrifugal selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm, semua pekejaan ini dilakukan dalam suasana dingin.
d. Kemudian didapatkan endapan pelat 20% dan supernatan I
e. Supernatan 1 digunakan untuk pengendapan Amonium sulfat 40%

B. Pengendapan dengan amonium sulfat 20-40%
  1. Superbatan I 10 ml dimasukan kedalam beaker glass dengan menambahkan 1,23 gr amonium sulfat secara perlahan-lahan kemudian di stirer
  2. Diamkan selama 30 menit pada suhu 40C
  3. Kemudia selama 10 menit di sentrifuse dengan kecepatan 10000 rpm, semua perlakuaan dilakukan dalam suasana dingin.
  4. Didapatkan Supernatan II dan endapan pelet 40%

C. Pengendapan dengan amonium sulfat 40-60%
  1. Supernatan II sebanyak 10 ml dimasukan kedalam beaker glass dengan menambahkan 1,32 gr amonium sulfat secara perlahan-lahan dan kemudian distirer.
  2. Diamkan selama 30 menit dengan suhu 40C kemudian sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm
  3. Maka akan didapat supernatan IV dan endapan pelet 60%
Dialisis Enzim
  1. Sebanyak 6 ml fraksi I dan fraksi II, kemudian 2 ml fraksi III
  2. Masing-masing fraksi dilarutkan kedalam bufer 0,2 M dengan pH 8 kemudian masukan kedalam kantong selofan
  3. Kemudian untuk larutan dialisis dengan menggunakan bufer fosfat 0,05 M dengan pH 8.
  4. Kemudian masukan kantong selofan yang telah berisi fraksi tadi kedalam larutan dialisis, usahakan agar kantong selalu mengambang didalam larutan dialisis. Biarkan selama semalam pada kondisi dingin.
  5. Fraksi dan bufer fosfat yang telah dimasukan kedalam kantong selofan pad f1 dibagi menjadi A:7ml, B:5,5 ml C:7ml dan D:7ml karena endapan terlalu kental dan banyak, f2:4,8 ml dan f3: 2,5 ml
  6. Bufer fosfat dalam kantong selofan ditambahkan dengan etanol absolute dingin dengan perbandingan 1:1 dan diinsersi
  7. Inkubasi dalam refrigerator selama 1 jam atau sampai endapan terlihat
  8. Sentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm, kemudian akan didapatkan pelet dan supernatan
  9. Supernatannya dibuang
  10. Pelet dikeringkan dan ditambahkan dengan bufer tris-Cl 1;1 kemudian simpan pada suhu -200C
  11. Maka akan dihasilkan enzim murni.

Informasi

loading...